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安培酶聯免疫分析法

安培法是酶聯免疫分析中另一種常用的電化學分析技術。它是將工作電極的電為控制在被測定物質能發(fā)生氧化/還原反應的某個確定電位上，當樣品中含有該物質時，就會產生可以檢測的電流，通過電流的大小就可以對該物質的濃度進行測定。由于該方法常應用在色譜和流動體系的電化學檢測器上，所以又稱為控制電位安培檢測。當色譜和流動體系中分離流出的化合物經過該檢測器時，可根據所產生的電流來判斷吧被測物質流出的時間，根據電流峰的大小來判斷化合物的濃度。由于電化學檢測器的靈敏度高、死體積小，所以在色譜和流動分析中應用廣泛。只要具有性的物質都可以進行測定，如苯酚類、硫醇類、硝基化合物、亞胺類、醌類、吩噻嗪類有機物，可以根據所測定的化合物的電化學性質選擇相應的測定電位。

安培法中zui簡單、zui常用的模式是在恒定的電位下測定待測物質的氧化還原電流，這種恒電位測量模式可以避免雙電層充電和表面瞬變效應，因而信噪比高，可以達到很低的測定下限，還可以根據需要改變電位的各種參數，采用不同的電位脈沖檢測模式如示差脈沖安培法、反向脈沖安培法、三脈沖安培法，或是采用雙電極或多電極檢測模式，以達到檢測低濃度樣品的要求。

    安培酶聯免疫分析常用的酶-底物體系

由于安培法可以檢測有電化學活性的有機物，如苯酚類，所以理論上只要酶催化反應的產物含有有些電活性基因，均可用安培法進行測定。在酶免疫分析中應用較多的是堿性磷酸酶，其酶催化水解產物為相應的醇或酚，可以用安培法進行檢測，特別是電化學氧化對其測定的報道較多，采用的工作電極有碳電極、金屬電極、化學修飾電極等。美國Cincinati大學的 Heine-man等人在這方面做了大量工作，他們采用不同的免疫分析模式，結合不同的工作電極，以及各種電化學測定技術，測定了多種臨床樣品和藥物。他們zui早用AP電化學酶免疫分析的底物是磷酸苯酯，在酶的催化作用下發(fā)生水解反應生成苯酚，可在電極上氧化而產生氧化電流，氧化電流的大小同酶的濃度有關系，進而可用于酶免疫分析。但是由于苯酚的電化學氧化過程為不可逆過程，測定時苯酚電氧化產物會吸附在電極表面而污染電極，導致測定靈敏度下降，同時氧化電位太高而造成檢測時背景電流較大，所以采用其他底物的報道日益增多。已被研究的底物有對氨基磷酸苯酯、對甲氧基磷酸苯酯、a萘酚磷酸苯酯等，其酶催化水解產物均為酚類物質，可以用安培法測定其氧化電流的大小進而測定其酶的活力。

   液相色譜安培酶聯免疫分析

液相色譜（HPLC）具有非常的分離效率，是一種選擇性好、靈敏度高的分離分析方法。HPLC的檢測器有紫外吸收檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器等。由于電化學檢測器具有死體積小、響應速度且具有線性響應關系好、價格便宜等優(yōu)點，所以近十幾年來在HPLC方面的發(fā)展十分迅速。酶催化反應后的溶液通常是混合組分，將其與HPLC聯用后利用色譜加以分離并除去相應干擾物，可以有效地提高待測物質的測定靈敏度。在液相色譜安培酶免疫分析操作中應注意以下幾個問題。

    流動相和樣品

 在HPLC中流動相的選擇非常重要，一方面它起載體作用，將酶催化反應的產物同樣品中的其他物質如未反應的底物、蛋白質等進行分離：另一方面它還要作為電化學檢測的支持電解質起導電作用，所以一般選擇用導電性溶液作為流動相。一般反相色譜的流動相具有有極性，可用于電化學檢測器，而正相色譜可以通過加電解液后柱、采用大體積的壁噴式檢測器等方法來改善電化學檢測器的適應性。另外在待測物質的氧化還原反應中常常會消耗或產生質子，因此在實驗中控制流動相的pH也是十分重要的。一般來說緩沖液的濃度在0.01~0.1mol/L，其組成和pH的選擇要根據待測物質的實際情況加以確定。溶劑和電解質的純度越高，背景和噪聲電流越低。

生物樣品中常會含有蛋白質等大分子，在酶免疫分析過程中也可能因為抗原抗體復合物的解離而使樣品中存在抗原、抗體等大分子物質，這些物質的存在可能會對分離柱或電極產生污染或毒害，所以有時為了檢測的要求需對樣品進行純化或預先凈化。凈化過程常用沉淀法將蛋白質去除，或采用一個前柱來進行樣品凈化處理。

    工作電極

待測物質的電化學行為會因為工作電極材料的不同而有區(qū)別，而且不同的電極材料的背景電流也會有所不同，因此要根據待測物質的氧化還原性質來選擇檢測器的工作電極。常用的電極有玻碳電極、碳糊電極、鉑電極、金電極、汞電極以及不銹鋼電極等。玻碳電極是zui常用的工作電極，它具有較寬的電位范圍，可以在正電位范圍內檢測被測物質的氧化電流，而且對普通有機溶劑呈惰性，氣體也不能參透，缺點是電極表面易于發(fā)生電聚合而造成污染，因此，每次測定前都要仔細處理使表面呈鏡面，以保證測定的重現性。碳糊電極也常用作工作電極，其背景電流低、噪聲較小、電極成本低，缺點是在含有機溶劑的流動相中膠黏劑會逐漸溶解。

 化學修飾電極也可用于HPLC的安培檢測。如在玻碳電極表面鍍上一層帶電聚合物膜，如聚4-乙烯基吡啶或陽離子交換劑Nafion ,就可以有效改善電極對相反電性被測物的分析性能。

工作電位的選擇

     在檢測過程中工作電極電位的選擇非常重要，電位較高時，待測物質反應*，但背景電位大、噪聲大選擇性不好，對檢測限有影響，而且工作電位與被測物質的電化學性質和流動相的組成有很大的關系。工作電位的選擇可以通過循環(huán)伏安法確定，方法是將待測物質

與流動相組成的混合溶液模擬電化學檢測器中的流出液，在常規(guī)電解池中用循環(huán)伏安實驗來了解待測物質的電化學信息，此法較為簡單。另一種準確的方法是流體動力學伏安法，它常用于安培檢測器工作電位的選擇，方法是在不同的電位下將被測物質的溶液重復的注入HPLC，同時用檢測器記錄相應的電流，得到不同電位下的電流曲線，一般是一個階梯形的伏安圖，每種物質都具有特定的半波電位和極限電流。通常工作電位選擇在階梯波的平臺位置，這樣被測物質可以*反應，有效提高反應的靈敏度。

安培檢測器的種類

      安培檢測器的種類很多，zui常見的有薄層式、管式和噴壁式，有關檢測器的設計可參見相關專著。一般來說檢測器的電解池設計應滿足以下要求：具有高靈敏度和高準確性，死體積小，結構簡單，易于維護和保養(yǎng)。流動體系或安培檢測器大體被分為二類：一類是在檢測過程中，只有1%~10%的分析物被電解，稱為安培檢測器：另一類是檢測過程中分析物100%被電解稱為庫侖檢測器，不管哪一種類的檢測器，都必須在施加一個工作電為的同時檢測相應的電流。由于電化學反應過程僅發(fā)生在電極表面而不是整個體系內，所以死體積的減小并不影響檢測的靈敏度。

           基本操作方法

      液相色譜安培酶免疫分析是將酶免疫分析、液相色譜分離和安培法檢測相結合的一種綜合性技術。它的基本方法是按照常規(guī)酶免疫分析的步驟完成免疫分析的過程和酶催化反應，然后將酶催化反應的產物注射到液相色譜中，利用HPLC的分離作用將酶催化反應的產物同其他干擾物質分離，zui后在相應的工作電位下用安培檢測器測定酶反應的產物在電極上的氧化/還原電流，進一步達到測定抗原抗體的目的。

流動注射安培酶聯免疫分析

流動注射分析（Flow injection analysis, FIA）是利用連續(xù)流動的液體來注入某體積的樣品。它具有進樣速度高（一般是100~300樣/h），響應時間快（從樣品注入到檢測器響應的時間一般小于1min）、儀器自動化程度高等優(yōu)點。